蛋白半干电转印槽

2009-06-03 　阅读数：1470　

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半干法western blot 操作规程

 

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。具体操作步骤如下：

1 实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。

目的蛋白分子大小(kDa)	胶浓度	转移时间(h)
80---140	8%	1.5-2.0
25---80	10	1.5
15--40	12	0.75
<20	15	0.5

 

2 转膜的实验操作

（1）滤纸和膜的准备 (在电泳结束前20分钟应开始准备工作)。

A.            检查是否有足够的transfer buffer，没有立即配制。

B.             检查是否有合适大小的滤纸和膜。

C.             将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。再转入transfer buffer中。

D.            将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transfer buffer 中。

（2）转移

A.            在电转移仪上铺好下层滤纸。一般用三层。

B.             将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transfer buffer到膜上，保持膜的湿润。

C.             将胶剥出，去掉stack gel，小心的移到膜上。

D.            剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

E.             将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。 倒上些transfer buffer，再铺两张靠胶滤纸。

F.             装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。

G.            转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

 

 

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